在之前的两篇文章《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者》和《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者（二）》中，我们已经介绍了FRET技术的基本原理、实验步骤和应用实例。本期将由尊龙凯时带领大家深入探讨FRET技术中常用的分析方法。

在FRET技术中，FRET效率的准确检测主要受到两个因素的影响：（1）光谱串扰，涵盖供体荧光串扰到受体通道以及在激发供体时直接激发受体。选择发射光谱分离较大的供受体荧光对可以有效降低光谱串扰。（2）参与FRET过程的供体和受体在荧光分子中的比例实际上并非所有分子都参与相互作用，因此不同方法对FRET效率的计算只能获得表观FRET效率。目前，FRET效率的常用分析方法主要包括荧光寿命成像、光谱法、受体漂白法以及敏化发射法。以下将逐个介绍这些常用的分析方法。

荧光寿命成像法 (FLIM-FRET)

荧光寿命成像法（FLIM-FRET）通过测量荧光基团从激发态恢复到基态的平均时间来分析FRET效率。这种方法的优势在于荧光寿命是荧光基团固有的特性，不受样品浓度等外部因素的干扰，但对微环境的变化非常敏感，能够反映转移能量的动态。FLIM-FRET方法通过测量供体和受体存在与否时的荧光寿命来确定FRET效率。虽然该方法具有高时空分辨率和灵敏度，但其昂贵的设备和操作的复杂性限制了其应用。

光谱法 (sFRET)

光谱法FRET（sFRET）依赖于供体和受体样本的发射光谱，通过拟合分析获取供体-受体样品的光谱以计算FRET效率。此方法在检测灵敏度上表现出色，能够检测到低于5%的FRET信号。尽管sFRET能有效减少背景光干扰，但对于数据获取的要求较高，需要严格校正背景光和自发荧光，这使得操作相对复杂。

受体漂白法 (AP-FRET)

受体漂白法（AP-FRET）利用供体在FRET存在时的荧光强度降低，以及受体漂白后供体荧光强度的恢复来计算FRET效率。这种方法操作简便，适用于普通共聚焦显微镜，因而应用广泛。然而，该方法由于细胞光漂白恢复和对活细胞的潜在损伤，限制了在单细胞内的多次测量与实时监测。

敏化发射法 (SE-FRET)

敏化发射法（SE-FRET）通过校正供体和受体间的光谱渗透来获取FRET图像和效率。此方法避免了荧光漂白对细胞的损伤，能够对光谱串扰和系统参数进行校正，因此特别适合用于活细胞的动态监测。尽管如此，SE-FRET需要多组样本获取校正因子，这增加了实验工作量，也是其应用的一大限制。

综上所述，本文介绍了常用的四种FRET分析方法。选择合适的FRET分析方法应根据实验需求及硬件支持进行，大家也可以随时联系尊龙凯时进行进一步探讨与交流。实践中，这些方法为我们了解生物分子互作与调控提供了宝贵的工具，助力生物医学的研究进展。